El catedràtic de Música de la Universitat de Salamanca, l’invident Francisco Salinas (1513-1590) i el mestre de capella de Sant Marc de Venècia, Gioseffo Zarlino (1517-1590), van ser dos teòrics musicals del segle XVI. Zarlino va ser el teòric més influent del Renaixement i destaca en el camp del contrapunt –una tècnica compositiva– i de l’afinació dels instruments. L’humanista Salinas, organista del Duc d’Alba i amic dels músics Orlando di Lasso, Tomás Luis de Victoria i del poeta Fray Luis de León, estudià els temperaments musicals i les relacions entre música i llenguatge.

L’any 1577 Francisco Salinas publica a Salamanca el seu tractat De musica libri septem que es divideix, com el seu nom diu, en set llibres. Els quatre primers parlen de la teoria de l’harmonia i els tres últims se centren més en la teoria del ritme. El primer, a més, es pot entendre com una introducció on presenta tota la matemàtica necessària per a l’estudi de la música. Els llibres segon i tercer es dediquen principalment a la problemàtica de l’afinació. El quart parla sobre les modalitats referents a l’harmonia. El volum cinquè introdueix el tema del ritme, i el sisè i setè se centren en l’estudi del ritme, però més enfocat a la mètrica i el vers. És un tractat que mostra i analitza diferents temperaments musicals i explica la teoria musical totalment, des de la seva relació amb les matemàtiques fins al ritme i la seva aplicació en la mètrica.

Per altra banda, el tractat Le istituzioni harmoniche de Zarlino, publicat a Venècia l’any 1558 (a l’exposició en edició del 1562), defensa que la música és per damunt de tot un coneixement i una ciència creada a través de veus i sons relacionats aritmèticament. Les seves investigacions sobre teoria musical van tenir una gran repercussió i van arribar a ser conegudes a tot Europa, sobretot a finals del segle XVI, especialment a països com Itàlia, França, Alemanya i Països Baixos. Zarlino estudià els intervals –distància entre notes– i va ser qui es va proposar donar-li més precisió al so i a l’afinació amb un sistema de dotze tons, a diferència dels vuit tons reconeguts per la teoria musical medieval (des de Boeci, al segle VI, i Guido d’Arezzo al segle XI). Zarlino va tenir una gran repercussió, encara que avui en dia l’afinació més utilitzada i més exacta és l’afinació temperada (partint del fet de que l’oïda humana és incapaç de distingir freqüències sonores o de vibracions molt properes, «temperar» consistia en templar o ajustar aquelles petites distàncies entre sons encara que propers, diferents –com per exemple el sostingut i el bemoll–, aproximant-los i fent-los iguals). Al llarg de la història de la música diferents músics i teòrics han proposat mètodes d’afinació diversos. Una prova d’això són alguns dels teclats del Renaixement que van arribar a tenir fins a 31 tecles per octava (diferenciant sostinguts i bemolls), com també, més endavant, va fer la música contemporània, que es va interessar per les microtonalitats (divisions sonores més petites que els semitons dels teclats actuals).